Il territorio è abitato fin dal Paleolitico e le sue grotte hanno dato rifugio alle prime comunità. Il reperto più straordinario è Delia , la "donna di Ostuni": lo scheletro di una giovane donna in avanzato stato di gravidanza, rinvenuto nella grotta di Santa Maria di Agnano e datato tra i venticinque e i ventottomila anni fa ; le stime divergono. Reperti agricoli neolitici provengono da Lamaforca e San Biagio .

Il primo centro abitato organizzato fu messapico . Quel popolo illirico, abile costruttore di strade e città, si stabilì nel Salento nel primo millennio a.C. — le fonti indicano sia il 1000 a.C. che il VII secolo — e il primo nucleo urbano di Ostuni è opera loro. Nel III secolo a.C. fu assorbita da Roma insieme al resto del Salento, sebbene rimanga ben poco dell'architettura romana.

Sotto gli Aragonesi la città prosperò come centro agricolo e commerciale, e le mura che cingono il centro storico sono opera aragonese.

La concattedrale è l'eccezione che conferma la regola dell'architettura pugliese. Iniziata nel 1435 e completata entro il 1495 , è in gotico tardo — raro in una regione prevalentemente romanica o barocca. Sorge sulla sommità del colle più alto e la sua facciata è tripartita, divisa da paraste: la sezione centrale termina in un timpano formato da due archi inflessi, le ali in mezze lunette, e una cornice gotica di archetti trilobati su mensole scolpite corre lungo i fianchi e attorno al transetto. In basso si aprono tre portali ogivali — la lunetta centrale reca un rilievo della Madonna col Bambino in gloria — ciascuno sormontato da un rosone. Il rosone centrale ha ventiquattro raggi ed è considerato uno dei più grandi e raffinati del suo genere in Europa; Cristo si erge al centro, circondato da colonnine che rappresentano le ore del giorno. All'interno, la pianta a croce latina a tre navate è stata restaurata così spesso che il XVIII secolo l'ha rifatta sostanzialmente, e il soffitto piano ospita tele di quel secolo.

Di fronte si trovano il Palazzo Vescovile e l'antico Seminario , uniti da un arco in pietra finemente lavorato che scavalca la strada tra i due edifici.

Il XVII secolo portò la peste e con essa la devozione che ancora oggi definisce la città. Per tradizione, a Sant'Oronzo si attribuisce la salvezza di Ostuni dal morbo, come avviene in altre città del Salento. È molto probabile che sia stato in questo stesso periodo che si affermò l'imbiancatura a calce: la calce veniva applicata contro il contagio e ciò che nacque come misura di salute pubblica divenne l'identità della città.

Nel 1771 fu scolpito ed eretto nella piazza principale l' obelisco barocco di Sant'Oronzo — alto quasi ventun metri — in segno di ringraziamento per la protezione del santo contro il colera e i terremoti.

Ostuni vanta anche un primato risorgimentale che le sue dimensioni non lascerebbero presagire. I suoi cittadini fondarono un circolo della Giovine Italia e una sezione della Carboneria e, durante i moti, Ostuni fu la prima città in Puglia a issare il tricolore .

A partire dagli anni Trenta del Novecento è diventata il principale centro turistico di quella che era ormai la provincia di Brindisi.